בדיקת PCR: בטיחות, נוהל, משמעות

מהי בדיקת PCR?

בדיקת PCR היא שיטת מעבדה המשמשת בביולוגיה מולקולרית וברפואה. הבדיקה משמשת לאיתור ישיר - ואפיון - של חומר גנטי. שיטת ה-PCR נחשבת על ידי מומחים לקלה לביצוע, ישימה אוניברסלית וחזקה.

במעבדה בדיקת PCR מורכבת משני שלבים. בשלב הראשון, החומר הגנטי הקיים מוגבר באמצעות תגובת שרשרת הפולימראז (PCR). זה מאפשר לבחון את העקבות הקטנים ביותר של DNA. זו גם הסיבה לכך שבדיקות PCR מגיבות ברגישות כה רבה.

בשלב שני, החומר הגנטי מופרד לפי תכונותיו, "ממוין" וכך מאופיין. במילים אחרות, המבנה העדין של ה-DNA נקבע.

ישנם יישומים אפשריים רבים: רופאים משתמשים בבדיקת PCR, למשל, לבדיקת ספוגיות לאיתור נוכחות של נגיף קורונה, תרומות דם ל-HIV או כדי לסנן ילודים לאיתור מחלות תורשתיות אפשריות. זיהומים חיידקיים - למשל עם פתוגן שחפת - או זיהומים טפיליים (מלריה) ניתן גם לברר באמצעות PCR.

הם גם עוזרים להרשיע עבריינים ברפואה משפטית על סמך טביעות האצבע הגנטיות שלהם או משמשים כבדיקות אבהות.

כמה זמן תקפה בדיקת PCR?

תוצאת בדיקת PCR תקפה בדרך כלל למשך 48 שעות מרגע נטילת הדגימה.

עד כמה אמינה בדיקת PCR?

PCR היא שיטת זיהוי בדוקה באבחון מולקולרי וברפואה. זה נחשב לתקן הזהב שנקרא עם שיעור שגיאות נמוך מאוד. הבדיקות מתאפיינות במיוחד ברגישות ובספציפיות גבוהות מאוד.

רגישות פירושה המהימנות שבה בדיקה מוצאת את החומר הגנטי שיש לגלות.

ספציפיות פירושה הוודאות שבה הבדיקה קובעת שהחומר הגנטי המדובר אינו קיים בדגימה.

מתי בדיקות PCR פועלות לזיהום Sars-CoV-2?

ככלל, בדיקת ה-PCR מזהה זיהום בקורונה יומיים עד שלושה לפני ועד 20 יום לאחר הופעת התסמינים. אפילו באנשים נגועים שנשארים ללא סימפטומים לחלוטין, הבדיקה יעילה בחלון זמן קריטי שבו הם יכולים להדביק אחרים.

במקרים בודדים, גילוי אפשרי אפילו 60 יום לאחר הופעת התסמינים.

מקורות תקלות אפשריים

שיעור השגיאות בתהליך העתקת ה-DNA זניח בפועל. למרות שפולימראזות DNA לעולם אינן נקיות משגיאות, הן כמעט לא ממלאות תפקיד בהליך בדיקת ה-PCR.

בפועל, מקורות הטעות הפוטנציאליים טמונים יותר באיסוף הדגימות: לכן חשוב שאנשי מקצוע רפואיים מיומנים יבצעו את הספוגיות. דגימות רוק וגרגור עלולות להפחית את דיוק הבדיקה, מכיוון שמתרחשות כאן השפעות דילול.

כיצד פועלת בדיקת PCR?

בדיקת PCR מתבצעת, למשל, על ידי רופא משפחה או במרכזי בדיקה מיוחדים. ראשית, רופאים או אנשי מקצוע רפואיים מיומנים לוקחים דגימה. ספוגית נלקחת בדרך כלל מדרכי הנשימה העליונות לצורך הבדיקה. זה בדרך כלל לובש צורה של פה או ספוגית אף.

אפשר גם גרגור בתמיסת שטיפה. דגימת דם היא לא טיפוסית לגילוי קורונה - אבל בשימוש נרחב בהקרנת יילודים, למשל.

ללא קשר לסוג הדגימה שנלקחה, חומר גנטי נמצא על צמר גפן, בתמיסת השטיפה או בטיפת הדם. חומר מדגם זה נשלח למעבדה, שם הוא מבודד ומטוהר.

לאחר מכן בדיקת PCR מחולקת לשני שלבים:

• PCR: בשלב זה, מוגברת כמות החומר הגנטי הראשוני.

שלב 1: PCR - "תגובת שרשרת הפולימראז"

ה"PCR" הוא הראשון מבין שני שלבים: זה המקום שבו מוגברת כמות ה-DNA ההתחלתי הזמין. הסיבה לכך היא שניתן לנתח חומר גנטי רק לאחר שהוא זמין בכמות מספקת. ברוב המקרים מדובר ב-DNA אנושי; במקרה של בדיקות לקורונה, מדובר ב-RNA ויראלי.

הקיצור PCR מייצג "תגובת שרשרת פולימראז".

מה צריך עבור PCR?

ה-DNA ההתחלתי מונח בכלי תגובה עם חומרים מיוחדים. החומר הגנטי הקיים משמש כתבנית, המועתקת בנוכחות אנזימים מסוימים (Taq polymerase) ואבני בניין בסיסיות של DNA.

תהליך ההעתקה מתרחש במספר ריצות (מחזורים) חוזרות.

באופן ספציפי, החומרים הבאים מתווספים יחד:

• התחלת DNA: חומר לדוגמא שיש להעתיק.
• אבני הבניין הבסיסיות של ה-DNA: אלו הם הנוקלאובאס אדנין, תימין, ציטוזין וגואנין.
• DNA פולימראז: אנזים המקשר בין אבני בניין DNA בודדות ליצירת גדיל DNA מוגדר היטב. הגדיל החדש שהושג הוא תמונת מראה (משלימה) של חומר המוצא המקורי.
• פריימרים: הם מורכבים מ-16 עד 24 זוגות בסיסים ומשמשים כעמדת מוצא וכאות התחלה. פריימרים מראים את ה-DNA פולימראז באיזה מיקום (של ה-DNA ההתחלתי) מתחיל תהליך ההעתקה.

כיצד מתבצעת בדיקת PCR?

כעת, כשכל החומרים הנדרשים ל-PCR נמצאים בכלי התגובה, תהליך ההעתקה בפועל של החומר הגנטי יכול להתחיל. זה מופעל, נשלט ונפסק שוב רק על ידי הטמפרטורה.

לכן כלי התגובה מחומם או מקורר לטמפרטורות שונות בזה אחר זה. זה נעשה באמצעות מכשיר מיוחד המכונה מחזור תרמי. התגובה כולה אורכת כשעה עד שעתיים.

השלבים האישיים של מחזור PCR הם

• דנטורציה של גדילי ה-DNA הכפולים: הדגימה מחוממת לסביבות 90 מעלות צלזיוס. זה מפריד את גדיל ה-DNA הכפול המקורי לשני גדילים בודדים בודדים (משלימים).
• הצמדת הפריימרים: הטמפרטורה יורדת לקצת מתחת ל-60 מעלות צלזיוס. זה גורם לפריימרים (פריימר קדימה, פריימר הפוך) להיצמד למיקומים מוגדרים על גדילי ה-DNA המתאימים.

לאחר סיום מחזור, הטמפרטורה עולה שוב לסביבות 90 מעלות צלזיוס - המחזור מתחיל שוב מההתחלה.

ניתן להשתמש בשיטת PCR להגברת רצפי DNA של עד כשלושה זוגות קילובאזים (kbp). זה מתאים לכ-3,000 אבני בניין בסיסיות של DNA המקושרות יחד ליצירת "שרשרת". לשם השוואה: הגנום האנושי מאחסן את השרטוטים והמידע לפעולת התא בכשלושה מיליארד זוגות בסיסים - גנום הקורונה, לעומת זאת, מורכב מ-30,000 זוגות בסיסים. לכן, בדיקת PCR יכולה להגביר ולבחון רק חלקים קצרים מה-DNA הכולל.

הפריימרים הם קריטיים

בחירת הפריימרים היא קריטית להליך ה-PCR. באבחון Sars-CoV-2, למשל, משתמשים במספר פריימרים (Multiplex PCR).

בדיקות PCR של קורונה מחפשות לפיכך שלושה גנים שונים של וירוסים: זה מגדיל את הספציפיות הכוללת לכמעט 99.99%. המשמעות היא שעם שיעור הפגיעה הגבוה הזה, יש רק בדיקה חיובית שגויה אחת לכל 10,000 בדיקות (אם דגימות נלקחות כהלכה).

כמה חומר גנטי מועתק זמין כעת?

הבה נניח ששני גדילי DNA כפולים זהים קיימים לאחר המחזור הראשון.

לאחר כל מחזור, כמות החומר הגנטי (המועתק) מוכפלת. לכן כמות ה-DNA גדלה באופן אקספוננציאלי.

רופאים בדרך כלל חוזרים על תהליך זה בסביבות עשרים עד שלושים פעמים.

באופן פיגורטיבי, זה אומר שגם אם רק גדיל דנ"א יחיד נמצא בדגימה בהתחלה, אחרי עשרים מחזורים יש כבר מיליון עותקים זהים בכלי התגובה.

מה המשמעות של ערך Ct?

מספר מחזורי ה-PCR המופעלים מצוין בצורה של מה שנקרא ערך Ct. "Ct" נגזר מהמונח האנגלי "סף מחזור". ערך Ct זה מאפשר להצהיר על כמות החומר הגנטי שמחפשים.

עם ערך Ct נמוך של 20, יש הרבה חומר גנטי התחלתי. עם זאת, אם ערך ה-Ct גבוה - בסביבות 30 מחזורים - יש מעט DNA בהתאם. לכן יש להפעיל את מחזור ה-PCR לעתים קרובות יותר.

שלב 2: אלקטרופורזה "מיון לפי גודל"

ברגע שקיים מספיק חומר גנטי "מועשר", ניתן לבצע אלקטרופורזה. בתהליך זה, מדענים מנצלים תכונה ספציפית של ה-DNA: המטען החשמלי שלו.

אבני הבניין הבודדות של ה-DNA מקושרות זו לזו באמצעות עמוד שדרה טעון (שלילי) של סוכר-פוספט. ככל שרצף DNA מסוים ארוך יותר, כך המטען החשמלי שלו גבוה יותר.

זה מאפשר לבחון ולאפיין את החומר הגנטי. בפועל, דגימה לא ידועה משורטטת בדרך כלל מול התייחסות ידועה ב"קו התחלה" ומשווה זו לזו לאחר פרק זמן מסוים.

אם "מהירות ההגירה" זהה עבור שני הרצפים, פירוש הדבר שהזיהוי הוא ככל הנראה חיובי: סביר מאוד שהזיהוי חיובי - הגן שאתה מחפש כלול בדגימה.

מקרה מיוחד של קורונה: הכנת דגימה ו-RT-PCR

גילוי נגיף הקורונה הוא מקרה מיוחד. Sars-CoV-2 הוא אחד ממה שנקרא וירוסי RNA. המשמעות היא שהחומר הגנטי Sars-CoV-2 קיים בצורה של RNA (חומצה ריבונוקלאית).

RNA שונה מ-DNA רק בכמה בחינות. בין היתר, הוא קיים כגדיל בודד ומבוסס על ריבוז הסוכר במקום 2'-דאוקסיריבוז. תימין נוקלאובאס מוחלף גם באורציל כבסיס הרביעי.

RNA ויראלי זה חייב להיות "תעתיק" ל-DNA לפני בדיקת PCR רגילה. תהליך זה נקרא שעתוק לאחור (RT) - ומכאן המונח RT-PCR. כחלק מתהליך זה מתקבל גדיל יחיד של cDNA ("DNA משלים"). בשלב נוסף, הגדיל הבודד cDNA מתווסף על ידי גדיל DNA שני בתמונת מראה.

כמה זמן לוקח להגיע לתוצאה?

לאחר שליחת הדגימה למעבדה, לרוב תקבלו תוצאה תוך יום עבודה אחד או שניים. במרכזי בדיקה, שלעתים קרובות בוחנים את הדגימות ישירות באתר, זה יכול לקחת רק כמה שעות. טווח הזמן תלוי במידה רבה במרכז הבדיקה המתאים ובלוגיסטיקה שלו.

למרות תהליכי העבודה המורכבים, מעבדות מודרניות מסוגלות לבצע בדיקות PCR בתפוקה גבוהה. מכשירים אוטומטיים מיוחדים עוזרים לבצע את הבדיקות.

עם זאת, בדיקת PCR נחשבת לשיטת זיהוי "איטית" יחסית אך אמינה יותר.

מה קורה אם התוצאה חיובית?

אם הדגימה נלקחה בצורה נכונה, בדיקת PCR חיובית פירושה שיש סבירות גבוהה מאוד שהאדם הנבדק נגוע ב-Sars-CoV-2.

אם אושרו להידבקות בנגיף הקורונה באמצעות בדיקת PCR, מחלקת בריאות הציבור תקבל הודעה על תוצאת הבדיקה החיובית מהמעבדה הרלוונטית. במקרה כזה, מחלקת בריאות הציבור תורה על בידוד או הסגר.

האם אני מדבק אוטומטית אם אני מבחן חיובי ל-PCR?

בדרך כלל כן. אבל לא תמיד. יש לפרש תמיד תוצאת בדיקת PCR בהקשר. בדיקה חיובית פירושה בראש ובראשונה שאתה נושא חומר ויראלי.

בדיקת נוגדנים משלימה היא לפעמים שימושית

במקרים כאלה, בדיקת נוגדנים מספקת ודאות המאשרת את תקפות בדיקת ה-PCR. עדיף לדון בזה עם הרופא שלך. הם יכולים לעזור לך לפרש את תוצאת בדיקת ה-PCR בצורה נכונה.

מה לעשות אם התוצאה שלילית?

תוצאת בדיקת PCR שלילית פירושה ככל הנראה שלא היה לך קוביד-19 בזמן נטילת הדגימה ולכן אינך מדבק כרגע. עם זאת, אתה יכול להיות בשלב מוקדם של זיהום.

בדרך כלל ניתן לזהות זיהומי קורונה רק מהיום השני או השלישי לאחר ההדבקה. התוצאה היא אפוא לא מעבר חופשי. לכן עליך להמשיך לשמור על כללי התרחקות חברתית והיגיינה ולהמשיך ללבוש מסכת FFP2 - להגנה שלך ושל אחרים.

בדיקת PCR לילדים

בדיקת PCR לילדים אינה שונה מבדיקת PCR למבוגרים. גם איסוף המדגם וגם הפרשנות של התוצאות חלים על ילדים וגם על מבוגרים.

מהם הסיכונים בבדיקת PCR?

בדיקת PCR אינה כרוכה בסיכונים פיזיים כלשהם. רק איסוף הדגימה באמצעות ספוגית אף נתפסת על ידי אנשים מסוימים כמטרידה או לא נעימה.

מה עולה בדיקת PCR?

שימו לב: אם בדקתם את עצמכם בבית וקיבלתם תוצאה חיובית, יש לקבוע תור לרופא המשפחה באופן מיידי בטלפון. הרופא שלך ידון איתך בטלפון על השלבים הבאים.

לחילופין, עדיף להתקשר למספר 116 117 כדי להירשם לבדיקת PCR. באופן אידיאלי, עליך להישאר בבית עד לבדיקת האישור כדי להגן על עצמך ועל אחרים.